豆科植物在世界范圍內普遍種植，廣泛應用于食 品、化妝品和制藥等領域，但由于加工不當，常引發(fā) 中毒類型的食源性突發(fā)公共衛(wèi)生事件 。 豆科植 物中主要含植物凝集素和皂苷 2 種毒性物質，含有的 蛋白酶抑制劑、脂肪氧化酶和植酸等抗營養(yǎng)物質也會 促進中毒發(fā)生或者加重中毒癥狀。目前對豆科植 物食源性中毒診斷的實驗室檢驗尚無統(tǒng)一的國家標 準，本研究選擇常見豆類蔬菜——豆角，對其所含皂 苷和紅細胞凝集素的毒性、溶血性和紅細胞凝集性進 行了試驗研究，為豆科植物食物中毒的實驗室診斷提 供方法與評價依據。現將結果報道如下。

SPF 級 SD 大鼠，體重 180～220 g， 由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許 可證號：SCXK- （京） 2012-0001。大鼠飼養(yǎng)于 SPF 級實驗動物房，溫度 20～25 ℃，相對濕度 40%～ 70%，合格證號：SYXK （津） 2014-0001。

熒光倒置顯微鏡 （日本奧林巴斯），ario Skan Flash 光柵型多功能酶標儀 （美國 Threom） ， Centrifuge 5810 高速離心機（德 國 Eppendorf），GNP-9050隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司），多功能果蔬料理機，皂苷快速定性試劑盒，48 孔聚苯乙烯血凝 板，新鮮兔血、雞血。

平行稱取 50 g 豆角 4 份，150 g 豆角 4 份，分別于沸水中煮沸 0、3、5、10 min，冰 盒降溫，吸去表面水分，果蔬料理機制成勻漿，并加 入生理鹽水 30 mL，為不同煮沸時長Ⅰ號勻漿和Ⅱ號 勻漿。平行稱取 150 g 豆角 4 份，同法制成勻漿，4 層紗布過濾，并加入生理鹽水 30 mL，為不同煮沸時 長Ⅲ號濾液。

參照 GB 15193.3—2014 《急性經口毒性試驗》，人用量按 200 g/60 kgbw 計 算。大鼠隨機分為 8 組，每組 10 只，雌雄各半，狀 態(tài)良好，同性別大鼠個體間體重差異不超過 15%。 大鼠經口灌胃 0、3、10 min 組Ⅰ號勻漿，劑量分別 為 20.0 g/kgbw （記為低劑量組，相當于人用量的 6 倍 ， 灌 胃 量 為 36、 30、 29 mL/kg） 和 40.0 g/kgbw （記為中劑量組，相當于人用量的 12 倍，灌胃量為 71、60、56 mL/kg）；經口灌胃 0、3 min 組Ⅲ號濾 液，劑量為 75.0 g/kgbw （記為高劑量組，相當于人 用量的 22 倍，灌胃量為 73、63 mL/kg；受試物 5 h 內分 2～3 次給予，觀察 2 周內大鼠中毒癥狀和死亡情況。

取煮沸 0、3、5、10 min 的Ⅰ號勻漿和Ⅲ號濾液，采用皂苷快速定性試劑盒法 檢測皂苷含量，若比色管出現淡黃色至磚紅色可判斷 為皂苷陽性，顏色越深表明皂苷含量越高。陰性對照 為生理鹽水。

新鮮兔血脫纖維抗凝，配成 2%兔紅細胞混懸液。取 ４ 種不同煮沸時長的Ⅱ號勻 漿和Ⅲ號濾液各 0.5 mL，加入 48 孔聚苯乙烯血凝板 為第 1 孔，從第 2 孔起用生理鹽水倍比稀釋，然后每 孔加入等量 0.5 mL 2%兔紅細胞懸液，混勻，每個濃 度做 2 個平行孔，并設陰性對照 （生理鹽水 + 2%兔 紅細胞懸液） 和陽性對照 （蒸餾水+2%兔紅細胞懸 液）。于 37 ℃恒溫孵箱中靜置，每隔 0.5 h 觀察紅細 胞溶解情況，觀察 4 h。4 h 后，1 500 r/min 離心 10 min，取上清液，575 nm 處測定吸光度 （OD），計 算溶血率。溶 血 率 （%） = ［（ODt-ODn ）c / （ODpcODn ）c ］ ×100%。式中，ODt 為試驗管吸光度，ODnc 為陰性對照管吸光度，ODpc 為陽性對照管吸光度。溶 血率＞5%為溶血。

新鮮雞血脫纖維抗凝，配 成 1%雞紅細胞混懸液。取 4 種不同煮沸時長的Ⅱ號 勻漿和Ⅲ號濾液各 0.5 mL，加入 48 孔聚苯乙烯血凝 板為第 1 孔，從第 2 孔起用生理鹽水倍比稀釋，然后 每孔加入等量 0.5 mL 1%雞紅細胞懸液，混勻，每個 濃度做 2 個平行孔，并設陰性對照 （生理鹽水 +1% 雞紅細胞懸液）。37 ℃恒溫孵箱中靜置，每隔 0.5 h 觀察紅細胞凝集情況，觀察 4 h。4 h 后取出，若溶 液有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振搖后不分散，表明 有紅細胞凝集發(fā)生，并進一步判定是真凝聚還是假凝 聚：將凝聚物放在載玻片上，在蓋玻片邊緣滴加生理 鹽水，顯微鏡下觀察，凝集紅細胞能被沖散者為假凝 聚，記為“-”；否則為真凝聚，記為“+”。

采用 SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計分析，率的 組間比較采用 Fisher 確切概率法，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.1 受試物大鼠體內毒性試驗結果 低、中劑量組 大鼠灌胃后約 0.5 h 出現趴臥 （染毒后臨床癥狀）， 分別在 6 h 和 24 h 后基本恢復正常；高劑量組大鼠 灌胃后約 0.5 h 出現趴臥，24 h 后基本恢復正常。觀 察期內大鼠體重呈增長趨勢，大體解剖主要臟器未見 異常，無死亡個體。不同處理時間不同劑量組大鼠出 現趴臥癥狀的比例差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。 見表 1。
 

2.2.1 皂苷快速定性試劑盒法 0、3、5 min 組Ⅰ號 勻漿和Ⅲ號濾液比色后均出現淡黃色至棕紅色變化， 為皂苷陽性，顏色隨著煮沸時間的增加而變淡； 10 min 組Ⅰ號勻漿和Ⅲ號濾液均不顯色。

2.2.2 溶血性試驗結果 陰性對照組溶血率為 0，陽 性對照組溶血率為 100.00%。Ⅱ號勻漿 0、3、5、 10 min 組原液和 0、3、5 min 組 1∶2 稀釋液的溶血 率均＞5%，溶血性試驗結果陽性；Ⅲ號濾液 0、3、 5、10 min 組原液、1∶2 稀釋液，3、5 min 組 1∶4、 1∶8 稀釋液以及 3 min 組 1∶16 稀釋液的溶血率均＞ 5%，溶血性試驗結果陽性。見表 2。

3 討 論

試驗結果顯示，新鮮豆角的大鼠急性經口毒性為 實際無毒 。NCIRI 等  研究發(fā)現，用未加工的 菜豆干豆粉 （Beldia，bean） 制成混懸液，經口灌胃 Wistar 大鼠，300 mg 連續(xù) 10 天，未見大鼠出現明顯 的臨床中毒癥狀或死亡。

本試驗采用改良溶血試驗評價豆角樣品的溶血 性，利用全波長酶標儀比色，簡化了檢測步驟，對采 樣量的要求更為靈活；紅細胞凝集試驗采用熒光倒置 顯微鏡觀察，使結果判斷更為直觀準確。皂苷快速檢 測、改良溶血試驗和紅細胞凝集試驗法聯合使用可初步判斷豆科植物食源性中毒。今后研究應對皂苷和凝 集素進行提純，以便提高檢出率，消除干擾因素，同 時應考慮酸堿度 （pH 值）、溫度和提取方法等對皂苷 和凝集素活性的影響，使這 2 種物質的毒性評價更加 可靠。