營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal proteins, Vips)是由蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringi? ensis, Bt)營養(yǎng)生長期分泌的一種殺蟲蛋白?最早由 Estruch等(1996)從蘇云金芽胞桿菌AB88菌株離心 的上清液中發(fā)現(xiàn)?Vip3A 蛋白對鱗翅目昆蟲具有 廣譜的殺蟲活性,與任何已知的殺蟲晶體蛋白均沒 有同源性;隨著害蟲對殺蟲晶體蛋白抗性的產(chǎn)生, Vip 蛋白成為一個極為豐富且潛力巨大的資源 (Beard et al., 2008; Ramasamy et al., 2008; Yu et al., 2012)。

關(guān)于Vip蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究,迄今主要集 中在Vip3Aa (Song et al., 2016)?但是,與目前研究 比較深入的殺蟲晶體蛋白相比,關(guān)于 Vip3 蛋白的 結(jié)構(gòu)?功能及作用模式等方面的報道較少,并且未 得出一致的結(jié)論(Chakroun et al., 2016)?部分研究 表明,絲氨酸突變對Vip3Aa殺蟲活性影響較大,例 如,Vip3Aa11氨基端的第9位絲氨酸突變?yōu)樘於?胺(S9N)?第193位絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸(S193T)后, 對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉鈴蟲(Heliothis armigera)的殺蟲活性有明顯提高(Liu et al., 2017)? Dong 等(2012)將 Vip3Aa7 中的半胱氨酸突變?yōu)榻z 氨酸,獲得的突變體(C292S, C507S, C401S)對小菜 蛾(Plutella xylostella)殺蟲活性明顯降低,甚至喪失 活性?Chi等(2017)將Vip3Aa的543位絲氨酸突變 為天冬酰胺(S543N)?686 位絲氨酸突變?yōu)榫彼?(S686R),獲得的突變體對甜菜夜蛾殺蟲活性分別 提高5倍和8.98倍。

雖然前人已經(jīng)對Vip3Aa11的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 進行了一些探索,但要完全闡明 Vip3Aa11 的殺蟲 機理尚需更廣泛的研究?本課題組比對Vip3Aa11 與Vip3Aa39氨基酸序列的差異,選定3個位于活性 中心區(qū)?可能參與絲氨酸突變的位點進行定點突變，利用甜菜夜蛾和棉鈴蟲進行殺蟲活性測定，并 進行胰蛋白酶敏感性及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，旨在探 尋影響殺蟲活性的氨基酸位點及其殺蟲活性變化 原因，為殺蟲機制研究提供基礎(chǔ)材料。

定點突變所用的質(zhì)粒pET-vip3Aa11?大腸桿菌 (Escherichia coli) BL21(DE3)和 JM109 菌株均由東 北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室保存? 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 和 DpnⅠ (DMT)酶購自 TransGen Biotech (北京);質(zhì)粒提取 試劑盒?DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen (美國); PageRuler Prestained Protein Ladder 購 自 Thermo Scientific (美國);Gel Red 核酸染料購自 BIOTIUM (美國)。

根據(jù) vip3Aa11 基因(GenBank No. AAR36859) 全長序列,通過 DNAMan 7.0 設(shè)計定點突變引物, 引物設(shè)計包含5'端重疊區(qū)和3'端延伸區(qū);除突變位 點外,引物長度大約25~30 bp,5'端重疊區(qū)包含15~ 20 bp,3'端延伸區(qū)包含至少10 bp?突變位點位于2 條引物上,分別位于正向突變引物重疊區(qū)下游?緊 鄰重疊區(qū)和反向突變引物 5'端?引物由上海生工 生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以轉(zhuǎn)化 E. coli JM109 菌株的 pET-vip3Aa11 質(zhì) 粒為模板,分別以G200S-F/R?F442S-F/R和S726TF/R為引物(表1),PCR擴增含突變位點的vip3Aa11 基因全長片段?PCR反應(yīng)體系均為:質(zhì)粒1 μL,正反向突變引物(10 μmol/L)各 1 μL,2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL,加 ddH2O 至 50 μL? PCR 反應(yīng)條件均為:94 ℃預(yù)變性 2 min;94 ℃變性 20 s,55 ℃退火 20 s,72 ℃延伸 3 min,23 個循環(huán); 72 ℃延伸10 min? 為有效篩選突變克隆,需利用DMT酶體外降 解非突變型質(zhì)粒模板?因此,將1 μL DMT酶加入 50 μL PCR產(chǎn)物中,混合均勻,于37 ℃孵育1 h?取 5 μL酶消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21,挑取單克隆并送 至吉林省庫美生物科技有限公司進行序列測定分 析,以驗證預(yù)期突變位點的堿基變化是否正確。

挑取1.3中含預(yù)期突變位點的E. coli單菌落于 5 mL 液體 LB 培養(yǎng)基,于 37 ℃?220 r/min 活化過 夜?以 1% 接種量接種于 50 mL LB 液體培養(yǎng)基, 于 37 ℃?220 r/min 培養(yǎng) 2~2.5 h,直至 OD600 約為 0.5?加入終濃度為 1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫 代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG), 于 150 r/min?16 ℃誘導(dǎo) 12 h;于 4 ℃?8 000 r/min 離心 8 min,收集菌體沉淀 ;以 5 mL 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)懸浮;經(jīng)超聲波破碎(參數(shù)設(shè)置: 功率 70%; 超聲 3 s, 間隙 1 s, 全程 3 min),于 4 ℃? 12 000 r/min離心15 min,收集上清液。

取 Vip3Aa11 及其突變體蛋白樣品加入 5×上 樣緩沖液,混勻并煮沸 8 min,于 12 000 r/min 離心 1 min,取 5 μL 上清液進行 SDS-PAGE,電壓為 120V,分離膠濃度為10%?然后以考馬斯亮藍(lán)R250進 行凝膠染色?對于凝膠上的蛋白條帶,使用軟件 QuantityOne 4.5進行定量分析:選取3個已知濃度 的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 為蛋白定量標(biāo)準(zhǔn),選取凝膠空白區(qū)為背景(background),選取 Vip3Aa11 及其突變體中 88 kD 的目 的條帶,經(jīng)軟件處理得到目的蛋白濃度。

在室內(nèi)殺蟲活性測定中,稱取30 g人工飼料置 于培養(yǎng)皿中,分別與3 mL不同濃度的Vip3Aa11及 其突變體蛋白樣品混合,均勻分裝于24孔板中;其 中,甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的殺蟲活性測定設(shè) 置 80?40?20?10?1?0.1 μg/mL 等 6 個濃度,棉鈴蟲 (Heliothis armigera)的殺蟲活性測定設(shè)置 200?100? 50?25?5?1 μg/mL等6個濃度?選取健康的?未經(jīng) 取食的初孵幼蟲(孵化后12 h內(nèi), 購自河南省濟源 白云實業(yè)有限公司)作供試蟲,用軟毛筆輕移入已 有感染飼料的小孔內(nèi);每孔1頭蟲,每個處理重復(fù)3 次?以轉(zhuǎn)化pET28a質(zhì)粒空載體的菌體總蛋白作為 陰性對照,以未發(fā)生突變的 Vip3Aa11 野生型蛋白 作為陽性對照?在每個小孔上方鋪上濕潤衛(wèi)生紙 后蓋上塑料蓋,以橡皮筋捆緊,豎立放入30 ℃ (棉 鈴蟲)或25 ℃ (甜菜夜蛾)光照培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司提供）;培養(yǎng)7 d后調(diào) 查 活 蟲 數(shù) ,并 觀 察 幼 蟲 生 長 情 況 ,使 用 POLO (1987)軟件計算致死中濃度(median lethal concentration, LC50)?以野生型Vip3Aa11的LC50與其他殺 蟲蛋白LC50的比值作為相對毒力。

1.7 胰蛋白酶敏感性分析

按照1.4步驟提取Vip3AA11及其突變體蛋白， 以 PBS 溶液(pH 8.0)代替 20 mmol/L Tris-HCl。將 蛋白樣品與1 mg/mL胰蛋白酶按照10∶1的比例混 合均勻，于37 ℃水浴中分別放置2和32 min，加入 5×蛋白上樣緩沖液終止反應(yīng)，然后進行SDS-PAGE 分析。

以pET-vip3Aa11質(zhì)粒為模板,利用含突變位點 的引物進行 PCR 擴增?PCR 產(chǎn)物經(jīng) DMT 酶消化 后,取5 μL轉(zhuǎn)化E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,獲得的單 克隆菌落用vip3AF/R引物對進行PCR鑒定?結(jié)果 顯 示 ,Vip3Aa11 及 其 3 個 突 變 體 G200S?F442S? S726T均能擴增出預(yù)期的2 370 bp目的條帶(圖1), 說明陽性單克隆菌落中含有vip3Aa11 基因或突變 基因?對于每個定點突變樣品，選取2個經(jīng)PCR鑒定 正確的單克隆進行測序。對測序結(jié)果進行序列分 析，均實現(xiàn)預(yù)期的點突變。

蘇云金芽胞桿菌營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3Aa對多 種鱗翅目害蟲具有較好的殺蟲活性,并且被證實與 目前應(yīng)用較多的殺蟲晶體蛋白無交互抗性,具有廣 闊的應(yīng)用前景?Vip3Aa 類蛋白是被發(fā)現(xiàn)?研究報 道 最 多 的 一 類 Vip 蛋 白 ,并 且 Vip3Aa19 與 Vip3Aa20 已經(jīng)成功的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物中(Yu et al., 1997; Yu et al., 2001)。