0 引言

蜈蚣藻是大型紅藻，生長在低潮線，中國沿海地區(qū) 均有分布，可以進行規(guī)模化的人工養(yǎng)殖。蜈蚣藻多糖 是一種硫酸酯多糖，具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血 、 降血脂、降血糖 、抗疲勞等眾多生物活性。益生元是指不被宿主消化吸收卻能有選擇性地促進其體內(nèi)雙 歧桿菌等有益菌的生長和繁殖，從而改善宿主健康的 有機物質(zhì)。益生元目前有功能性低聚糖類、多糖類、天 然植物提取物、多元醇等類別 。目前研究主要集中 在低聚糖類物質(zhì)，如瓊膠寡糖和褐藻膠低聚糖都是新型益生元。

1 材料與方法

1.1 實驗時間、地點

實驗于2018年7—8月在中國科學院海洋研究所實驗室進行。

1.2 實驗材料、儀器

1.2.1 材料

蜈蚣藻由中國科學院海洋研究所提供，雙 歧桿菌由青島優(yōu)比特生物技術(shù)有限公司提供，大腸桿 菌為中科院海洋研究所生物技術(shù)中心保存菌種，金黃 色葡萄球菌為中科院海洋研究所生物技術(shù)中心保存菌 種。

1.2.2 試劑

95%乙醇（國產(chǎn)分析純級），MRS固體培養(yǎng) 基（青島日水生物技術(shù)有限公司），MHB培養(yǎng)基（青島 海博生物技術(shù)有限公司）。

1.2.3 主 要 儀 器

Hitech- Kflow Water Purification System（上海和泰儀器有限公司），SARTORIUS 精密 分析天平（德國 SARTORIUS 公司），RV10 旋蒸儀（德 國IKA公司），YXQ-LS-100A壓力蒸汽滅菌鍋（上海博 訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），F(xiàn)D-1冷凍干燥機（北京德天佑科技發(fā)展有限公司），DK-S24精宏水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），DHG-9070A烘箱（上海精宏 實驗設備有限公司），超聲清洗儀，96 孔板，接種環(huán)， iMark酶標儀（BIO-RAD公司），78-1型磁力加熱攪拌 器（常州國畫電器有限公司），722S分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），AIRTECH潔凈工作臺（蘇州 安泰空氣技術(shù)有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏 實驗設備有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 蜈蚣藻多糖的制備

用燒杯稱量 40 g 干燥蜈蚣 藻，用剪刀剪碎，置于錐形瓶中，封口，加水至料液比1: 60。使用壓力蒸汽滅菌鍋100℃加熱120 min，篩去雜 質(zhì)后進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將其灌入透析袋中依次使用 靜水、流水、蒸餾水進行透析除鹽，第2次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃 縮后加3倍體積的95%乙醇醇沉（過夜）。過濾并收集 沉淀，將其平鋪于物料盤中冷凍干燥12 h得到蜈蚣藻 粗多糖。干燥至恒重后，計算提取率并將其在陰涼通風處保存。

1.3.2 蜈蚣藻多糖對雙歧桿菌益生效應的實驗

（1）配制MRS固體培養(yǎng)基200 mL，滅菌后取3 mL 于厭氧管中制成斜面。配制100 mL 1%的雙歧桿菌菌 液（1 g固體菌粉溶于100 mL無菌水），取100 μL接種 于厭氧管中，充氮氣營造厭氧環(huán)境，37℃下培養(yǎng)48 h后 轉(zhuǎn)入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br /> （2）配制液體 MRS 培養(yǎng)基，分裝至錐形瓶中，滅 菌，迅速冷卻至室溫后用接種環(huán)接種培養(yǎng)48 h的雙歧 桿菌，封口后再用 parafilm 封口膜封口，防止氧氣進 入，37℃下靜置培養(yǎng)48 h。
（3）準確稱取蜈蚣藻多糖樣品 0.100 g，在超聲清 洗儀下溶于10 mL無菌水，配成1%的溶液后分別稀釋 為 0.8%、0.6%、0.4%、0.2%，使接種后濃度分別變?yōu)?0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%。將培養(yǎng)48 h的雙歧桿 菌菌液從錐形瓶底部吸取少許，用MRS液體培養(yǎng)基稀 釋至0.5個麥氏比濁度。分別吸取稀釋后的菌液和各 濃度糖樣品溶液100 μL于96孔板的微孔中，每個樣品 的每個濃度設置8個平行，對照組加入100 μL稀釋菌 液和100 μL無菌水。
（4）接種完畢后用酶標儀在630 nm波長下測定吸 光度，放于37℃靜置培養(yǎng)，之后保持每隔6 h檢測吸光 度值，每次檢測完都用parafilm封口膜將96孔板四周封住 。

2 結(jié)果與分析

蜈蚣藻多糖對雙歧桿菌生長影響如圖 1，可以看出自接種6 h后各樣品開始明顯增長，在12 h時低聚果 糖和陰性對照組樣品基本不再增長達到平穩(wěn)，低聚果糖高于對照組，且隨低聚果糖濃度增大而增大。5 個蜈蚣藻多糖樣品在21 h之前一直比較接近并保持增 長，但21 h之后濃度較高的0.5%、0.4%、0.3%保持平穩(wěn) 增長，0.2%、0.1%在 24~42 h 中有明顯下滑，之后 42~48 h迅速增長并接近0.5%、0.4%、0.3%。在66 h 5個蜈 蚣藻多糖樣品最終結(jié)果較接近，仍保持增長趨勢，且顯 著高于低聚果糖組。

蜈蚣藻多糖與低聚果糖對金色葡萄球菌和大腸桿 菌作用結(jié)果較為接近，都沒有抑制作用，都具有較弱的 促進生長作用。鑒于低聚果糖已經(jīng)商業(yè)化并應用于工 業(yè)及食品行業(yè)，可以初步判斷蜈蚣藻多糖較安全，但仍 需要進行進一步的體內(nèi)實驗，以了解它在體內(nèi)復雜的 環(huán)境下被消化酶分解的情況，以及是否具有通過促進 雙歧桿菌等有益菌的生長抑制大腸桿菌等病原菌等有害菌生長的作用。

3 結(jié)論

蜈蚣藻多糖對雙歧桿菌的增殖具有顯著的促進作用，但是從0.3%濃度到0.5%濃度的增長，沒有提升對 雙歧桿菌增殖的促進作用，可見在此范圍內(nèi)蜈蚣藻多 糖濃度與益生效應沒有明顯的相關關系，但蜈蚣藻多 糖的促進作用顯著優(yōu)于低聚果糖。因此，蜈蚣藻多糖 具有較好益生效應。蜈蚣藻多糖對雙歧桿菌增殖的促 進作用與濃度在一定范圍內(nèi)具有一定正向關系，如果 經(jīng)過進一步的實驗驗證，可以被開發(fā)為一種新的、更為 高效的益生元，調(diào)節(jié)人體的免疫力、增強體質(zhì)，或者作 為雙歧桿菌的促生長因子而應用于酸奶的發(fā)酵工業(yè) 中。