資料與方法

一、實驗動物

健康雄性清潔級ＳＤ 大鼠８０只，鼠齡３～４個月， 體質量２３０～２７０ｇ，由西安交大醫學院實驗動物中心 提供，許可證號ＳＣＸＫ（陜）２０１２－００３。

二、主要儀器與試劑

主 要 儀 器 包 括 Ｋｅｎｄｒｏ 低 溫 高 速 離 心 機 （德 國 Ｓｏｒｖａｌｌ公司）、ＤＹＮＥＸ ＭＲＸⅡ型酶標儀（日本 Ｄｙｎｅｘ 公司）、Ｏｌｙｍｐｕｓ光 學 顯 微 鏡（日 本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司）、 ＲＭ６２４０Ｂ多通道 生 理 信 號 采 集 處 理 系 統（成 都 儀 器 廠）、ＹＰ１００ 型 壓 力 換 能 器 （成 都 儀 器 廠 ）、 ＳＨＨＷＺＩＣＹ４２０型電熱恒溫水浴箱（北京長安科學儀 器廠）、精宏DHG-9023A型 電 熱 恒 溫 鼓 風 干 燥 機（上 海 精 宏公司）、ＤＹＹ－８ 型 穩 壓 穩 流 電 泳 儀 （上 海 琪 特）、 Ｋａｄｏｋ ＤＣｓ－１２０ 凝 膠 圖 像 分 析 系 統 （美 國 Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）等。主要試劑包括雷帕霉素（華北 制 藥 股 份 有 限 公 司，國 藥 準 字 Ｈ２０１０００７９），Ｅ－ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 等 抗 體 均 購 自美國ＳａｎｔａＣｒｕｚ公 司，四 氯 化 碳 油 溶 液、組 織 細 胞 裂解液、ＥＣＬ 發 光 增 強 劑、兔 二 抗 工 作 液、ＤＡＢ 顯 色 劑等均購自美國 ＰＩＥＲＣＥ公司。

三、實驗方法

（一）纖維 化 動 物 模 型 制 作 及 用 藥 取 健 康 雄 性 清潔級ＳＤ大鼠３２只，依據３ｍＬ／ｋｇ體質量皮下注射 四氯化碳油溶液４０ｍｌ／Ｌ，２次／周，持續８周，制備四 氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型。其中，雷帕霉素干預 組于第６周同時按２ｍｇ／ｋｇ體質量行雷帕霉素灌胃 處理，１次／ｄ，維持２周。另取１６只大鼠納為正常組。 所有大鼠均于第８周處死。
（二）標本獲 取 及 保 存 （１）肝 臟 組 織 標 本：既 定 時間 點 處 死 大 鼠，開 腹 后 于 腹 主 動 脈 取 血，完 整 切 離 肝臟，分別于各肝葉處取一塊肝臟（厚約４ｍｍ），甲醛固定、常 規 脫 水、石 蠟 包 埋 處 理 后 將 剩 余 肝 臟 組 織 切 塊，置入凍存管 中，于液氮條件下保存；（２）肝 細 胞 提 取：以原位加體外循環膠原酶灌注ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度離 心法，行大鼠肝細胞分離。大鼠腹腔打開后經門靜脈 插管，注 入 肝 素 鈉 抗 凝，５０ｍＬ 注 射 劑 緩 慢 灌 注 無 鈣 Ｄ－ＨＡＮＫＳ液。沖洗肝臟，干凈后０．０５％膠原酶液行 肝臟原位灌注，速度１０ｍＬ／ｍｉｎ，２ｍｉｎ后行肝上下腔 靜脈 結 扎，將 肝 臟 取 出，行 膠 原 酶 液 灌 注 至 肝 組 織 變 軟、蒼白。肝臟抖動并鈍性分離細胞，２００鉑不銹鋼篩 網過濾后洗滌，離心處理后獲取肝細胞，置入凍存管， 于液氮罐凍存備用。
（三）肝臟組 織 ＨＥ 染 色 （１）肝 臟 組 織 切 片：切 片前將包埋好的標本置入－２０ ℃冰 箱 冷 凍３０ ｍｉｎ。 切片厚度３～５μｍ，于普通載玻片上粘附后于６０℃條 件下烘烤，６０ｍｉｎ后取出裝盒；（２）ＨＥ染色：石蠟切片 脫蠟至水，經 ＰＢＳ沖 洗、蘇 木 青 染 色、鹽 酸 酒 精 分 化、 ＰＢＳ漂洗等處理后晾干后中性樹膠封片，鏡檢。
（四）肝臟組 織 中 α－ＳＭＡ 表 達 檢 測 （１）載 玻 片 及蓋 玻 片 處 理、切 片：載 玻 片 洗 凈 后 置 入 多 聚 賴 氨 酸 溶液（經１∶１０去離子水稀釋）中，浸泡５ｍｉｎ后烘烤 裝盒。切片于載玻片上粘附后烘烤裝盒；（２）免 疫 組 化：石蠟切片脫 蠟 至 水，經 ＰＢＳ沖 洗、浸 泡、滴 加 二 抗 工作 液、蘇木素復染等處理后中性樹膠封 片，鏡 檢。 采用免疫組化檢測肝組織中α－ＳＭＡ 表達。
（五）蛋白 表 達 檢 測 將培養瓶中的細胞用細 胞 刷刮下后，經勻漿、Ｓ－ＰＡＧＥ膠制備、上樣、電泳、轉膜、 封閉、結合一抗、洗滌、曝光顯影、定影 ＨＲＰ－ＥＣＬ發光 處理后，運用 Ｅｐｓｏｎ彩色圖像掃描儀獲取蛋白質信號 條帶圖像。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ測定蛋白表達。 四、觀察指標 分析三組肝 臟 組 織α－ＳＭＡ 染 色、ＨＥ 染 色 結 果， 對比 三 組 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表 達，并觀察三組上皮間質 轉化通路重要蛋白 ｐ－ ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４表達，探討雷帕霉素 抑制肝纖維化進程中肝細胞上皮間質轉化機制。 五、統計學方法 采用ＳＰＳＳ１９．０ 軟 件 處 理 數 據。以 百 分 率（％） 表示計數資料，組間行χ ２ 檢驗；以（ｘ珔±ｓ）表示計量資料，組間行ｔ值檢驗。Ｐ＜０．０５為差異有統計學意義。

結　　果

成功建立四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型，模型 對照組和雷帕霉素干預組在８周時各有１只死亡，均 經α－ＳＭＡ 組化、ＨＥ染色證實。經 ＨＥ染色發現雷帕 霉素干預 組 肝 纖 維 化 顯 著 減 輕，經 免 疫 組 化 行 經 α－ ＳＭＡ 再次驗證。模型對照組 肝 臟 中 肝 細 胞 內Ⅰ型膠原表達較正 常組明顯增 高（Ｐ＜０．０５），上 皮 標 志 物 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、 ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表達較正常組明顯減少（Ｐ＜０．０５），間 質細胞標志 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表達較正常組明顯增高 （Ｐ＜０．０５），上皮間質轉化通路重要蛋白 ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４ 較 正 常 組 明 顯 增 高 （Ｐ ＜ ０．０５）。雷帕霉素干預組肝臟內肝細胞Ⅰ型膠原表達 及 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表 達 較 模 型 對 照 組 顯 著 下 降（Ｐ ＜０．０５），肝細胞 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表達較模型 對 照 組 明 顯 增 高 （Ｐ ＜０．０５），ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、 ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４表達較模型對照組顯著下降 （Ｐ＜ ０．０５）。

討　　論

近年來有研究表明，肝細胞上皮間質轉化與肝纖 維化有關。Ｎｉｓｈｉｋａｗａ等采用 ＴＧＦ－β１處理體外 培養所致大鼠成熟肝細胞，發 現 肝 細 胞 經 ＴＧＦ－β１處 理后 白 蛋 白 表 達 明 顯 下 降，Ⅰ 型 膠 原 表 達 上 升；而 ＴＧＦ－β１處理后尚存活肝細胞伴上皮間質轉化，推 測 肝纖維化 中 肝 細 胞 上 皮 間 質 轉 化 起 著 重 要 作 用。王 川林等發現，肝纖維化中纖維組織母細胞部分源于 成熟肝細 胞。四 氯 化 碳 誘 導 大 鼠 肝 纖 維 化 模 型 屬 接 近肝炎肝纖維化模型。本研究經建立該模型發現，大 鼠肝纖維化過程中成熟肝細胞發生上皮間質轉化，Ｅ－ ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表 達 明 顯 減 少，間 質 細 胞 標 志 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表達明 顯 增 高，且發現這類肝細胞 分泌Ⅰ型膠原增多，預示肝纖維化過程中肝細胞上皮 間質轉化發揮著重要作用。本研究發現，肝細胞內上 皮間質轉化通路重要蛋白ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／ ３、ｓｍａｄ４明顯增高，進一步證實肝細胞上皮間質轉化 參與肝纖維化過程。




 

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