隨著大量廣譜抗菌藥物的廣泛和不合理應(yīng)用，銅 綠假單胞菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性日趨 嚴(yán) 重。 而氨基糖苷類修飾酶介導(dǎo)耐藥的多重耐藥銅綠假單 胞菌可引起呼吸道感染、泌尿道感染、菌血癥、心內(nèi)膜 炎 和 囊 性 纖 維 變 性 等 疾 病，往 往 會 給 重 癥 監(jiān) 護(hù) 室 （ＩＣＵ）合并感染的患者帶來更為嚴(yán)重的后果和經(jīng)濟(jì)損 失。本研究通過 ＰＣＲ 檢測４種氨基糖苷類修飾酶基 因ａｎｔ（２″）－Ⅰ、ａｎｔ（３″）－Ⅰ、ａｎｃ（６′）－Ⅰ和ａｎｃ（６′）－Ⅱ， 探討其在ＩＣＵ 多重耐藥銅綠假單胞菌中的表達(dá)情況， 分析多重耐藥銅綠假單胞菌中氨基糖苷類修飾酶介 導(dǎo)的耐藥機(jī)制，從而為ＩＣＵ 臨床醫(yī)師的合理用藥提供 理論依據(jù)。

１ 材料與方法

１．１ 菌株來源

選擇２０１７年１月至２０１８年１２月本 院ＩＣＵ 臨床標(biāo)本中分離的６０株多重耐藥銅綠假單胞 菌株為研究對象，所有試驗(yàn)菌株均經(jīng)法國生物梅里埃 公司 ＶＩＴＥＫ－２型全自動細(xì)菌鑒定／藥敏分析系統(tǒng)鑒 定。質(zhì)控菌株為 ＡＴＣＣ２７８５３。

１．２ 試劑與儀器

ＴａｑＤＮＡ 聚合酶、１０×Ｔａｑ緩沖 液、三磷 酸 堿 基 脫 氧 核 苷 酸 （ｄＮＴＰｓ）、細(xì) 菌 基 因 組 ＤＮＡ 提取試劑盒、ＤＮＡ 膠回收試劑盒、１００ｂｐ分子 標(biāo)記物、１ｋｂ分子標(biāo)記物，均購自天根生化科技有限 公司；ＬＢ肉湯培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限 公司；低溫高速離心機(jī)和ＰＣＲ擴(kuò)增儀為Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司產(chǎn)品；電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品；生物安全柜 為 Ｔｈｅｒｍｏ公司產(chǎn)品；Ｇｅｎｅｇｅｎｉｕｓ紫外凝膠成像分析 系統(tǒng)為基因公司產(chǎn)品。ＰＣＲ 引物為ｒｐｓＬ 管家基因， 參考 ｗｗｗ．ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｃｏｍ／（ＩＤ：ＰＡ４２６８）上 的 ｒｐｓＬ基因序列自行設(shè)計，所有引物委托Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司合成。見表１。

１．３ 方法

采用 ＰＣＲ檢測４種氨基糖苷類修飾酶基 因ａｎｔ（２″）－Ⅰ、ａｎｔ（３″）－Ⅰ、ａｎｃ（６′）－Ⅰ和ａｎｃ（６′）－Ⅱ。

１．３．１ 細(xì)菌

ＤＮＡ 提取 用接種環(huán)挑取純菌落接種 于５ｍＬ的 ＬＢ肉湯培養(yǎng)液，將裝有 ＬＢ肉湯培養(yǎng)液的 試管置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中，３７ ℃，２００ｒ／ｍｉｎ，１８～２０ｈ 培養(yǎng)至細(xì)菌生長對數(shù)期。然后取３ｍＬ 培養(yǎng)液，按照 天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組 ＤＮＡ 提取試劑 盒操作說明進(jìn)行操作，提取的 ＤＮＡ 模板置于－２０ ℃ 保存?zhèn)溆谩?br />
１．３．２ ＰＣＲ 檢測修飾酶基因

ＰＣＲ 反應(yīng)體系設(shè)置 參照天根公司 ＴａｑＤＮＡ 聚合酶說明：模板１．５μＬ，正 向引物（ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ）０．５μＬ，反向引物（ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ）０．５μＬ， １０×Ｔａｑ緩沖液２．５μＬ，ｄＮＴＰ混合物２μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶０．５μＬ，雙蒸水（ｄｄＨ２Ｏ）補(bǔ)至２５μＬ。ＰＣＲ反應(yīng) 循環(huán)：９４℃、４ｍｉｎ，９４℃、３０ｓ，５５ ℃、３０ｓ，７２ ℃、４０ｓ （３０個循環(huán)）；７２ ℃、４ ｍｉｎ。ＰＣＲ 產(chǎn)物電泳分析：取 ５μＬ擴(kuò)增產(chǎn)物與 １μＬ６× 上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于 １％瓊脂糖凝膠，在１２０Ｖ 電壓下電泳３０ｍｉｎ；出現(xiàn)條 帶后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶并照相。陽性產(chǎn)物送 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司測序，所得測序結(jié)果在 ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù) 庫進(jìn)行同源性比對。

１．４ 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０對數(shù)據(jù) 進(jìn)行整理。

2 基因和 ａｎｃ（６′）－Ⅱ 基因

未檢測出 ａｎｔ（３″）－Ⅰ 和 ａｎｃ （６′）－Ⅰ基因。ＰＣＲ 陽性產(chǎn)物隨機(jī)各選取 １ 例送Ｉｎ－ ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司測序，測序結(jié)果在 ＧｅｎＢａｎｋ進(jìn)行同源性 比對，比 對 結(jié) 果 顯 示，ａｎｔ（２″）－Ｉ 基 因 和 登 錄 號 為 ＣＰ０３３１３１．１和 ＣＰ０２９０９０．１的ａｎｔ（２″）－Ⅰ基因同源 性為１００％，ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因與登錄號為 ＣＰ０３６２９４．１ 的銅綠假單胞菌的ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因同源性為１００％。結(jié) 果 　　所有菌株均能擴(kuò)增出ｒｐｓＬ基因條帶。６０ 株多重耐藥銅綠假單胞菌中檢測到含有氨基糖苷類 修飾酶基因的菌株共１６株，檢出率為 ２６．６７％（１６／ ６０）。８株含 ａｎｔ（２″）－Ⅰ 基因，檢出率為 １３．３３％（８／ ６０），見 圖 ２。１０ 株 含 有 ａｎｃ（６′）－Ⅱ 基 因，檢 出 率 為 １６．６７％（１０／６０）；其中兩株同時含ａｎｔ（２″）－Ⅰ基因和 ａｎｃ（６′）－Ⅱ 基因，未檢測出 ａｎｔ（３″）－Ⅰ 和 ａｎｃ （６′）－Ⅰ基因。ＰＣＲ 陽性產(chǎn)物隨機(jī)各選取 １ 例送Ｉｎ－ ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司測序，測序結(jié)果在 ＧｅｎＢａｎｋ進(jìn)行同源性 比對，比 對 結(jié) 果 顯 示，ａｎｔ（２″）－Ｉ 基 因 和 登 錄 號 為 ＣＰ０３３１３１．１和 ＣＰ０２９０９０．１的ａｎｔ（２″）－Ⅰ基因同源 性為１００％，ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因與登錄號為 ＣＰ０３６２９４．１ 的銅綠假單胞菌的ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因同源性為１００％。

3 討 論 　　

近年來，氨基糖苷類藥物的廣泛使用導(dǎo)致細(xì)菌對 其耐藥的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，這種現(xiàn)象在ＩＣＵ 中表現(xiàn)得 尤為突出。細(xì)菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性主要 取決于氨基糖苷類藥物修飾酶，氨基糖苷類藥物修飾 酶主 要 有 Ｎ－乙 酰 轉(zhuǎn) 移 酶 （ＡＡＣ）、Ｏ－核 苷 轉(zhuǎn) 移 酶 （ＡＮＴ）等，它主要通過共價修飾的方式使氨基糖苷類 藥物與核糖體的結(jié)合減少，促進(jìn)藥物攝取能量依賴期 階段二（ＥＤＰ－Ⅱ）也被阻斷，從而導(dǎo)致耐藥。ＡＡＣ 可以催化氨基糖苷類抗菌藥物１、３、６′和２′位點(diǎn)氨基 的乙酰化反應(yīng)，其中ａｎｃ（６′）－Ⅰ主要與阿米卡星的耐 藥相關(guān)，ａｎｃ（６′）－Ⅱ與慶大霉素和妥布霉素的耐藥相 關(guān)。ＡＮＴ 的作用主要是使氨基糖苷類抗菌藥物腺 苷化而失活，其中ａｎｔ（２″）－Ⅰ可使慶大霉素和妥布霉 素失活，但對奈替米星無修飾作用；ａｎｔ（３″）－Ⅰ與鏈霉 素的耐藥有關(guān)。